您当前的位置: 首页 > 育儿

研究首次获得基因敲入的食蟹猴

2019-03-10 23:40:36

1月12日,中国科学院神经科学研究所、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组与苏州非人灵长类研究平台孙强团队合作完成的研究成果,以《运用CRISPR/Cas9技术获得基因敲入食蟹猴》为题,发表在《细胞研究》上。该研究利用一种以同源臂介导的末端接合(Homology-Mediated End Joining, HMEJ)为基础的基因敲入策略,在世界上首次获得基因敲入的食蟹猴。由于基因修饰猴模型可用于模拟人类疾病症状,因此它可作为研究人类疾病机制和推进临床治疗的工具。然而,普通猴具有繁殖周期长(年一代),幼仔数量少(每胎一只)以及基因效率低等特点,导致构建靶向基因猴具有很大困难和挑战性。一些研究表明,CRISPR/Cas9系统可以用于构建基因敲除猴。与基因敲除相反,由于种种原因例如效率低,到目前为止仍未有基因成功敲入猴的报道。

基于实验室以往研究,同源臂介导的末端接合(HMEJ)的方法可以有效地在猕猴胚胎上实现高效的靶向基因整合。研究人员进一步优化受精卵注入条件,包括供体质粒浓度以及注射剂量,期望在提高敲入效率的同时保持正常的胚胎发育,进而获得基因敲入的猴子。

研究人员在Actb(β-actin)位点插入p2A-mCherry以实现mCherry在Actb启动子的控制下表达。在经历完整的怀孕周期后,获得一对双胞胎猴(#1,雄;#2,雌)和三只单胎的雌性猴 (#3、#4和#5)。通过直接表皮荧光观察两只新生猴(#1,#5)的脚趾发现,与野生型相比,#1和#5展现出mCherry荧光(图A)。对两只死亡雌猴子(#2,#3)的各个组织进行切片观察,发现尾巴、脚趾、心脏、肌肉、心脏、肾、大脑和卵巢均显示出不同嵌合程度的mCherry表达。研究人员在卵巢的大部分区域都检测到mCherry的表达,说明基因敲入猴子具有生殖系传递的可能性(图B)。所有组织的PCR鉴定测序结果都表明,在5’和3’连接处的整合是正确的。此外,Southern印迹分析进一步证实#2和#3猴的基因整合是正确且没有额外的基因随机整合(图C)。

研究人员利用CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略,通过一细胞胚胎注射首次获得基因靶向整合的食蟹猴。基于其强大的DNA敲入效率和高保真性,HMEJ介导的敲入策略为构建靶向基因修饰的猴模型提供了可能性。

研究工作得到了国家科技重大专项、中科院战略性先导科技专项、国家高科技研发项目国家自然科学基金会、中国青年千人计划、中科院重大突破项目、国家关键技术研发项目、上海市科学技术委员会项目、中科院百人计划等的资助。

用HMEJ策略获得Actb位点p2A-mCherry基因敲入猴。

(A)基因敲入食蟹猴幼仔。上部分,两只(1#和5#)存活幼仔的照片;下部分,两只(1#和5#)存活幼仔脚趾的荧光照片。红色箭头指示基因敲入猴的脚趾,黑色箭头指示野生型猴的脚趾。图片是从年龄相似的猴采集的:1#,5#和WT-1年龄都是大约1个月。

(B)两只死亡猴卵巢组织切片的mCherry和MVH的代表性荧光图片。MVH,

研究首次获得基因敲入的食蟹猴

原始精细胞的标记分子。插入图,高放大倍数图。蓝色,DAPI;绿色,MVH;红色,mCherry。标尺,100μm。(C)Southern Blot印迹杂交分析。NdeI酶消化和BglII酶消化的2#和3#猴子的基因组DNA分别用内部mCherry探针和3’外部探针进行杂交。内部mCherry探针期望的片段大小:野生型=无条带,基因整合=3.5Kb。3’外部探针期望的片段大小:野生型=4.4Kb,基因整合=5.4Kb。

推荐阅读
图文聚焦